低成本荧光和明场显微镜

要理解荧光显微镜的基本原理，想象一下夜晚一片茂密的森林，森林里充满了树木、动物、灌木丛以及森林中其他所有生物。如果你用手电筒照向森林，你会看到所有这些结构，而且很难看到特定的动物或植物。假设你只对森林里的蓝莓灌木丛感兴趣。为了实现这一点，你训练萤火虫只被蓝莓灌木丛吸引，这样当你看向森林时，只有蓝莓灌木丛会亮起来。你可以说，你给蓝莓灌木丛贴上了萤火虫的标签，这样你就能只看到森林里的蓝莓结构。

在这个类比中，森林代表整个样本，蓝莓丛代表你想要观察的结构（例如，特定的细胞或亚细胞器），萤火虫代表荧光化合物。只用手电筒照射而不使用萤火虫的情况类似于明视野显微镜。

下一步是了解荧光化合物（也称为荧光团）的基本功能。荧光团是纳米级的微小物体，被设计用于附着在样品中的特定结构上。它们吸收特定波长范围内的光，并重新发射其他波长的光。例如，一个荧光团可能吸收蓝光（即该荧光团被蓝光激发），然后重新发射绿光。通常，这可以用激发光谱和发射光谱来概括（如上图所示）。这些图显示了荧光团吸收的光的波长和发射的光的波长。

该显微镜的设计与普通的明场显微镜非常相似，但有两个主要区别。首先，照亮样品的光必须是激发荧光团的波长（例如，上例中光为蓝光）。其次，显微镜需要仅收集发射光（绿光），同时阻挡蓝光。这是因为蓝光会穿透样品，而绿光仅来自样品中的特定结构。为了阻挡蓝光，显微镜通常配备一种称为长通滤光片的装置，该装置允许绿光通过，而不会阻挡蓝光。每个长通滤光片都有一个截止波长。如果光的波长比截止波长长，则可以通过滤光片。因此得名“长通”。较短的波长会被阻挡。

以下是荧光显微镜的几个概述：

https://bitesizebio.com/33529/fluorescence-microsc...

https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescenc...

https://www.youtube.com/watch?v=PCJ13LjncMc

这是关于显微镜设计基本原理的额外步骤。对于构建荧光显微镜来说，这并非必需步骤，因此如果您不想深入研究光学原理，可以跳过此步骤。

明场显微镜和荧光显微镜都可以用射线光学建模。射线光学的基本原理是，光的行为类似于从光源传播的射线。当你环顾房间时，你会看到来自窗户外的太阳光，或者来自灯泡的光。这些光要么被房间内的物体吸收，要么被反射。其中一些反射光会射向你的眼睛。如果一个物体被照亮，你可以想象物体上的每个点都会向各个方向发射光线（如上图所示）。晶状体，就像我们眼睛里的晶状体一样，将光线聚焦到一个点，这样我们才能看到物体。没有晶状体，光线会继续向外传播，不会形成图像。

那么，我们如何制作能够放大小物体的光学系统呢？为了理解这个设计，你实际上只需要知道两个方程：薄透镜成像方程和放大方程：

1/f = 1/si + 1/so

M = -si/so

f 是镜头的焦距。焦距越短，镜头的聚焦能力就越强。

物体距离也是如此；镜头和物体（例如树）之间的距离。

si 是像距；即镜头与成像点之间的距离

M 是放大倍数；图像相对于物体的大小。对于显微镜，我们希望增加放大倍数。

有关薄透镜方程的完整教程，请观看可汗学院的这段视频。在上面的动图里，你可以看到物体靠近透镜时，像距会增加，从而放大倍数也会增加。带有两个箭头的垂直线代表透镜。

微距摄影 - 数码单反相机设计 1

从这些方程式可以看出，如果使用单镜头，那么放大图像的方法就是增加像距。这可以通过在相机中将镜头移离传感器来实现（见上图）。许多DIY微距摄影都是通过使用延长管简单地将镜头移出来实现的。这是一个很棒的技巧，可以作为昂贵微距镜头的廉价替代品。为了增加放大倍数，你也可以缩短镜头的焦距。镜头翻转的原因稍微复杂一些，需要了解光学系统的主平面。如果你想知道更多解释，请告诉我！

USB显微镜

USB显微镜的工作原理与此相同。它们经过特殊设计，能够对距离镜头非常近的物体进行成像。物体距离镜头越近，放大倍数就越大。它们还配备了多个可移动的镜头元件，让您能够在不同距离进行对焦，类似于变焦镜头。除了使用的镜头系统外，它们与网络摄像头非常相似。

智能手机设计

对于智能手机来说，像距是固定的（即无法移动镜头）。那么我们如何将其转换成显微镜呢？如果重新排列上面的公式，你会发现可以通过缩短镜头焦距来增加放大倍数：M = si/f -1。拆开手机更换摄像头镜头并不是最好的主意，所以你可以在手机外部添加一个双凸透镜。添加另一个镜头会缩短镜头系统的有效焦距。我见过有人使用一次性相机镜头和激光笔镜头。上图是光线图，粗略地展示了光线在这些不同系统中的弯曲情况。

无限远校正显微镜 - dSLR 设计 2

我在本教程中介绍的最终设计与实验室显微镜的设计最为相似。该设计包含两个透镜系统：物镜和镜筒透镜。物镜是最靠近样品的组件。样品放置在焦平面的正上方，因此物镜发出的光线实际上不会形成图像（即 si = 无穷远）。图像由镜筒透镜成像到传感器上。该系统的放大倍数由物镜和镜筒透镜焦距之比决定。您可以观看一段视频，了解更多关于采用此设计的明场显微镜的信息。

所有设计

补给品

激发 LED：WS2801/WS2811或高功率蓝光 LED

长通滤光片：Thorlabs、Edmund optics、Ealing，昂贵的选择：Semrock

用于握住过滤器的帮助手：https://www.amazon.com/ProsKit-900-015-Helping-Han...

准备好的显微镜载玻片：https://www.amscope.com/25-microscope-prepared-sli...

Arduino Nano

按钮

1kOhm电阻

4个M3x12螺栓

4X M3螺母

硬质塑料或盖玻片

荧光染料（例如荧光墨水、荧光素，还是这个？）

工具：

用于适配器的3D打印机

电钻

热胶枪

塑料吸管

剪刀

内六角扳手

LED灯带烙铁

1.智能手机设计

智能手机；我用的是 iPhone 5s

一次性相机镜头、激光笔镜头或Blips 镜头

智能手机支架

2. USB摄像头设计

USB 显微镜：https://www.amazon.com/Plugable-Microscope-Flexibl...

6mm直径磁铁

3. 数码单反相机设计

数码单反相机；我用的是尼康 D5000

筒透镜；180 毫米消色差双合透镜：https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumbe...

无限远校正物镜：https://www.amscope.com/10x-infinity-plan-achromat...

2英寸直径透镜筒：https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumbe...

F 型接口至 SM2 适配器：https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectg...

挡圈

荧光显微镜的一个关键区别在于光源。与明场显微镜使用的白光（即多种波长）不同，荧光显微镜需要的是特定颜色（即波长范围较窄）的光。例如，蓝光的波长约为 488nm。

我决定用可寻址 LED 灯带制作荧光显微镜，以便轻松在荧光和明场成像之间切换。该支架适用于本教程中展示的三种显微镜设计。我在 Fusion360 中设计了它，然后 3D 打印了三个部件。支架将 LED 灯带向内倾斜，以最大限度地增加照射到样品上的光线。在动图 (gif) 中，您可以看到它如何与 USB 显微镜集成。对于其他显微镜，它仅用于固定 LED 灯带。

首先将一个 M3 螺母放入黑色 LED 灯座的槽口中，然后滑入一个 M3x12 螺栓。螺栓和螺母充当固定螺钉，将 USB 显微镜固定到位。接下来，从 W2801 或 WS2811 LED 灯带上剪下八个 LED，并将 LED 推入孔中。将红色线连接到 5V，蓝色线连接到 Gnd，白色线（数据线）连接到 D2 引脚。对于显微镜，我想循环切换多种颜色，因此我添加了一个连接到 D3 引脚的按钮。附件是运行光源的代码。

接下来，将四个 M3 螺母固定在灰色 LED 底座的狭缝中，并将 LED 组件放在上面。盖上盖子，滑入 M3 螺栓，并用内六角扳手拧紧。然后，就可以将整个组件安装到圆形底部的黑色底座上。

荧光显微镜最难的部分或许在于制作标记样品。挑战在于如何将荧光团标记到特定结构上，这是一个复杂的化学过程。您可以订购荧光载玻片，例如这些小鼠肾脏载玻片，但它们价格昂贵。此外，您还可以购买校准载玻片，它们有助于验证您的荧光显微镜。

要自制低成本荧光载玻片，你需要准备荧光溶液（例如荧光笔、荧光素等）、硬塑料（或盖玻片）、透明胶带、塑料吸管以及一种能吸收荧光溶液的材料。将几滴荧光溶液滴到你想要在图像中发光的结构上。在我的例子中，我正在给一些纱线做标记。将物体放在纸巾上以吸收荧光溶液。记住，不要让荧光溶液沾到样本中的任何其他物质上！

确定标记物干燥后，将其与盖玻片上的其他样品放在一起。我准备了一张不加荧光液的薄纸。您可以使用一块剪成盖玻片大小的硬塑料来代替盖玻片。用胶带将样品粘在盖玻片上。现在就可以对荧光样品进行成像了！注意，荧光液可能会随着时间的推移而变干，导致荧光效果不佳。

我制作荧光样本的另一个想法是将一朵花放入荧光溶液中。荧光溶液会穿过植物的叶脉并标记它们。这里有更多关于荧光花的信息。

从一次性相机中取出镜头，然后使用 3D 打印机支架将镜头滑到智能手机上。如果您没有 3D 打印机，可以直接用胶带将镜头边缘粘在手机上。您还可以从Smart Micro Optics购买专为智能手机显微镜设计的更优质的镜头。

有了这些简单的设置，您手中就已经拥有一台超棒的数字明场显微镜了。这里还有一些关于如何搭建这类显微镜的资源。上面是我用一次性相机镜头和 iPhone5 拍摄的一些照片示例。如果您想了解这种方法的原理，请查看步骤 3。

现在把镜头转向荧光显微镜。将智能手机安装在三脚架上，并将光源放在智能手机后面。将荧光样品放在智能手机和光源之间。最后，用辅助手将滤光片移到样品和智能手机之间。滤光片会遮挡蓝色激发光。

这款显微镜的明场成像效果确实令人印象深刻，但我对荧光成像却感到失望。主要问题在于iPhone的自动色彩和曝光校正功能。如果无法控制这些功能，整个画面就会变成蓝绿色，荧光标记的细线也无法弹出。这个问题或许有解决办法，因为我找到了Qingshan Wei和Aydogan Ozcan合作的这款智能手机荧光显微镜。

首先，你需要 3D 打印滤光片支架。STL 文件如下。将所有磁铁朝同一方向粘到滤光片支架上。然后将磁铁朝相反方向粘到 LED 灯座上。当这两个组件都安装到 LED 灯座上后，它们会将滤光片锁定到位。将 USB 显微镜滑入 LED 灯座，并拧紧固定螺钉。你也可以在 USB 显微镜周围贴上美纹纸胶带，以确保牢固贴合。

要在明场显微镜和荧光显微镜之间切换，请滑动滤光片支架。长通滤光片位于 USB 显微镜前方，用于荧光成像。然后打开 LED 灯带，使正确的激发光（可能是蓝光）亮起。现在，将荧光样品滑入显微镜并保存一些图像。我使用 Mac 上的 Digital Viewer 程序来使用 USB 显微镜。以上是一些示例。结果真的让我印象深刻！

最终的设计放大倍数最高，画质最佳，但价格也最贵。将F口转SM2转接环安装到数码单反相机上，然后拧入一个2英寸和3英寸的延长管。之后安装180毫米消色差双合透镜。在物镜盖上钻一个孔，以便光线穿过，然后将其推入定制的物镜转SM2转接环（STL文件见上方）。在镜筒透镜后安装一个3英寸、2英寸和1.5英寸的延长管，最后安装物镜。

接下来，您需要将相机牢固地放置在桌子上，然后放置长通滤光片、样品和光源。我使用了CT 扫描仪项目中的数码单反相机接口（参见该说明的第 5 步），但您也可以使用三脚架。滤光片可以用辅助手固定到位。将滤光片移开即可进行明场成像。上面的前两个示例图像是同一个样品，一个在明场模式下，另一个在荧光模式下。请注意结构上的主要差异！我认为这是荧光显微镜实用性的最佳示例。如果样品标记清晰，您可以看到特定的结构，并遮蔽其他所有信息。

处理图像的另一个技巧是简单地提高对比度。您可以在上面包含明场和荧光图像的两张图片中看到这一点。

以上是荧光和明场成像结果的并排比较。单反相机的设计分辨率、对比度和整体图像质量最佳，但价格也最贵。我认为USB显微镜是安装和运行荧光显微镜的最佳选择。唯一的主要成本是长通滤光片，大约60美元。我仍在寻找更便宜的替代品来降低显微镜的整体成本。我对iPhone上的结果有点失望，但如果我能手动调整曝光和色彩校正，这个设计可能会有所改进（有什么想法吗？）。

与需要精细移动样品的数码单反相机相比，USB 显微镜上的调焦旋钮也使成像更加容易。市面上有高精度线性平台，但我能找到的至少要 100 美元。我用卡尺制作了一个便宜的线性平台原型，但这份说明里没有展示。MyPhotonics用乐高积木设计了一些很棒的平移平台。我还没试过，但它们看起来也是另一个很棒的低成本解决方案。