低成本荧光显微镜

理解荧光显微镜的基本原理

想象一下，夜晚有一片茂密的森林，里面有树木、动物、灌木以及其他各种生物。如果你用手电筒照射这片森林，你会看到所有的结构，但很难专注于某一种特定的动物或植物。

假设你只想观察森林中的蓝莓灌木。为了做到这一点，你可以训练萤火虫只被蓝莓灌木吸引，这样当你看向森林时，只有蓝莓灌木会发光。你可以认为你用萤火虫“标记”了蓝莓灌木，从而只看到森林中这部分结构。

在这个类比中：

1. 森林 代表整个样本
2. 蓝莓灌木 代表你想观察的特定结构（如某种细胞或细胞器）
3. 萤火虫 就是荧光化合物（荧光染料）

如果你只是用手电筒照明而没有萤火虫，这就相当于明场显微镜。

荧光化合物（Fluorophores）的作用

荧光化合物是非常微小的物质（尺寸在纳米级别），它们可以被设计成专门附着在样本中的某些特定结构上。

它们会吸收某一窄范围波长的光（称为激发光），然后发射出另一种不同波长的光（称为发射光）。例如，某个荧光染料可能吸收蓝光（即被蓝光激发），然后发出绿光。

这通常可以用激发光谱图和发射光谱图来表示（见上方图片）。这些图表展示了荧光染料吸收的光波长以及它发射的光波长。

显微镜的设计差异

荧光显微镜的设计与普通明场显微镜非常相似，但有两个关键区别：

1. 照明光源的波长必须能激发荧光染料：比如上面的例子中使用的是蓝光。
2. 显微镜必须只收集荧光染料发出的光（比如绿光），同时阻挡激发光（比如蓝光）。这是因为蓝光会散射到整个视野，而绿光只来自样本中特定的结构。

为了阻挡蓝光，显微镜中通常使用一种叫做**长通滤光片（longpass filter）**的装置。这种滤光片允许波长大于某个阈值的光通过，而阻挡更短波长的光。因此得名“长通（longpass）”。例如，如果截止波长是500nm，那么所有波长大于500nm的光可以通过，而小于500nm的光会被阻挡。

相关资源推荐：

1. Bitesize Bio 荧光显微镜介绍
2. Nikon MicroscopyU 荧光技术页面
3. YouTube 视频讲解

### 关于显微镜设计原理的补充说明（可选）

这是一个关于显微镜设计背后原理的额外章节。它不是制作荧光显微镜所必需的内容，如果你不想深入了解光学知识，可以跳过。

明场显微镜和荧光显微镜都可以使用**光线光学**（ray optics）来建模。光线光学的基本假设是：光像“射线”一样从光源传播出去。当你环顾房间时，你看到的是从窗外的阳光或灯泡发出的光。这些光要么被房间中的物体吸收，要么被反射。其中一些反射光会进入你的眼睛。如果一个物体被照亮了，你可以想象它表面上的每一个点都向四面八方发射出光线（如上图所示）。像我们眼睛中的晶状体这样的透镜，可以把这些光线重新聚焦到一个点上，这样我们就能看到这个物体。如果没有透镜，光线就会继续向外传播，无法形成图像。

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### 如何设计放大微小物体的光学系统？

要理解显微镜的设计，你只需要掌握两个公式：

#### 1. 薄透镜成像公式：

#### 2. 放大率公式：

其中：

- f 是透镜的焦距。焦距越短，透镜的聚焦能力越强。

- so 是物距，即物体与透镜之间的距离（比如一棵树）。

- si 是像距，即图像形成的位置与透镜之间的距离。

- M 是放大率，表示图像相对于实际物体的大小。对于显微镜来说，我们的目标是提高放大率。

如果你想了解薄透镜公式的完整教程，可以观看 [Khan Academy 的视频](https://www.khanacademy.org)。

在上面的动态图中，你可以看到当物体逐渐靠近透镜时，像距增加，从而导致放大率提升。图中带双箭头的竖直线代表透镜。

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### 1. 单反相机（dSLR）宏观摄影设计

根据上述公式可知，如果我们只使用一个透镜，想要放大图像，就要增加像距（si）。这可以通过将相机镜头远离感光元件（传感器）来实现（如上图所示）。许多DIY宏观摄影正是通过使用延长管（tube extender）将镜头拉远来实现的。这是一种便宜又实用的方法，可以替代昂贵的专用微距镜头。

当然，也可以通过**减小透镜焦距**来提高放大率。至于为什么有时需要把镜头倒过来使用，这就涉及到了光学系统中“主平面”的概念，稍微复杂一些。如果你感兴趣，我可以进一步解释！

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### 2. USB 显微镜的工作原理

USB 显微镜的工作方式与此类似。它们被专门设计用于拍摄非常靠近镜头的物体。物体离镜头越近，放大倍数就越高。此外，这类显微镜通常包含多个可移动的透镜元件，使你可以对不同距离的物体进行调焦，类似于变焦镜头。除了镜头系统外，它本质上就是一个网络摄像头。

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### 3. 智能手机显微镜设计

对于智能手机来说，像距是固定的（也就是不能移动镜头）。那怎么把它改造成显微镜呢？

如果你重新整理前面的公式，你会发现放大率也可以通过**减小镜头焦距**来提高：

拆开手机更换镜头并不是个好主意，因此可以在手机镜头外部加装一个**双凸透镜**。通过添加另一个透镜，可以有效缩短整个镜头系统的焦距。很多人使用一次性相机或激光笔中的镜头来达到这一效果。

上图是一个光线示意图，大致展示了光如何在这类不同的系统中发生折射。

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### 4. 无限远校正显微镜（dSLR 设计二）

这是我在本教程中介绍的最后一个设计，也是最接近实验室显微镜结构的一种。

该系统包含两个透镜组件：

- 物镜（Objective lens）：位于样本附近。

- 镜筒透镜（Tube lens）：用于将图像投射到传感器上。

样本被放置在物镜的焦点平面上，这样从物镜出来的光线不会立即形成图像（即像距 si = ∞）。然后由镜筒透镜将这些平行光线聚焦到传感器上形成图像。

该系统的总放大率为：

即镜筒透镜焦距除以物镜焦距。

### 所有设计方案所需材料和工具

#### 材料：

- 激发光源LED：WS2801/WS2811 或高功率蓝色LED

- 长通滤光片：可以从Thorlabs、Edmund Optics、Ealing购买，较为昂贵的选择是Semrock

- 用于固定滤光片的辅助工具

- 准备好的显微镜载玻片：[25片装显微镜载玻片]

- Arduino Nano

- 按钮

- 1k欧姆电阻

- 4个M3x12螺栓

- 4个M3螺母

- 坚固塑料或盖玻片

- 荧光染料（例如荧光笔墨水、荧光素等）

#### 工具：

- 3D打印机（用于制作适配器）

- 电钻

- 热熔胶枪

- 塑料移液管

- 剪刀

- 内六角扳手

- 焊接铁（用于LED灯条）

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### 各设计具体需求：

#### 1. 智能手机设计方案

- 智能手机：我使用的是我的iPhone 5s

- 一次性相机镜头、激光指示器镜头或Blips镜头

- 智能手机支架

#### 2. USB相机设计方案

- USB显微镜：[Plugable USB显微镜]

- 直径6毫米的磁铁

#### 3. dSLR设计方案

- dSLR相机：我使用的是我的Nikon D5000

- 镜筒镜头；180mm消色差双合透镜

- 无穷校正物镜

- 直径2英寸的镜筒

- F卡口到SM2适配器

荧光显微镜中的光源供应

荧光显微镜与明场显微镜的一个关键区别在于光源供应。明场显微镜通常使用包含多种波长的白光，而荧光显微镜则需要特定颜色（即窄范围波长）的光。例如，蓝色光的波长大约为488nm。

为了便于在荧光成像和明场成像之间切换，我决定使用可寻址的LED灯带来构建荧光显微镜。这个支架被设计用于本教程中展示的所有三种显微镜设计。我在Fusion 360中进行了设计，并3D打印了三个部件。该支架将LED灯以一定角度向内倾斜，以最大化照射到样本上的光线量。在动态图中可以看到它如何与USB显微镜集成在一起。对于其他显微镜，它仅用于固定LED灯。

制作步骤：

1. 安装M3螺母和螺丝：
2. 在黑色LED支架的槽中放入一个M3螺母，并滑入一个M3x12螺栓。这颗螺栓和螺母作为定位螺丝，用来固定USB显微镜的位置。
3. 安装LED：
4. 从WS2801或WS2811 LED灯带上剪下八个LED，并将它们推入孔中。
5. 将红色电缆连接到5V，蓝色电缆连接到GND，白色数据线连接到Arduino的D2引脚。
6. 因为我希望显微镜能够循环显示几种不同的颜色，所以我添加了一个按钮，连接到D3引脚。（附有运行光源供应的代码）
7. 组装LED底座：
8. 在灰色LED底座的缝隙中加入四个M3螺母，并将LED组件放在顶部。
9. 加上盖子，插入M3螺栓，并用内六角扳手拧紧。
10. 最后，整个组件可以安装在带有圆形底部的黑色基座上。

通过这种方式，你可以创建一个灵活且易于使用的光源模块，既适用于荧光成像也适用于明场成像。这种设计不仅提高了实验的便捷性，还允许用户根据需要调整光源的颜色和强度。

### 制作荧光样本的挑战与低成本解决方案

在荧光显微镜中，最困难的部分可能是制作标记了特定结构的样本。关键在于让荧光染料仅附着于特定结构上，这是一个复杂的化学过程。你可以订购如小鼠肾脏切片这样的荧光载玻片，但它们通常价格昂贵。校准载玻片也是可用的，并且对于验证你的荧光显微镜非常有用。

#### 低成本自制荧光载玻片的方法：

为了自己制作低成本的荧光载玻片，你需要准备以下材料：

- 荧光溶液（例如荧光笔墨水、荧光素等）

- 硬塑料或盖玻片

- 透明胶带

- 塑料移液管

- 能够吸收溶液的材料

##### 步骤：

1. 标记目标结构：向你希望在图像中发光的结构添加几滴荧光溶液。在我的例子中，我正在标记一些纱线。

2. 放置物体以吸收多余液体：将物体放在纸巾上来吸收多余的荧光液体。记住，你不希望荧光液体接触到样本中的其他部分！

3. 干燥处理：确保标记过的物体完全干燥后再将其加入到盖玻片上的其余样本中。我在样本中还加入了一张未接触荧光液体的纸巾作为对照。

4. 替代方案：如果没有盖玻片，可以使用切割成盖玻片尺寸的硬塑料代替。用胶带将样本固定在盖玻片或硬塑料上。

5. 成像准备：现在你已经准备好对荧光样本进行成像了！请注意，荧光溶液可能会随时间蒸发而效果减弱。

#### 另一种创意方法：

另一个关于制作荧光样本的想法是将一朵花放入荧光溶液中。荧光溶液会通过植物的脉络传播并标记这些脉络。这里有一些关于荧光花朵的更多信息。

### 取出一次性相机中的镜头，并使用3D打印的支架将镜头滑到智能手机上方。

如果你没有3D打印机，也可以用胶带把镜头边缘固定在手机上。

还有一些专门设计用于智能手机显微镜的高质量镜头，你也可以从 Smart Micro Optics 购买。

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### 仅凭这个简单的设置，你就已经拥有一台出色的数字明场显微镜了。

以下是一些关于制作这类显微镜的额外资源：

（此处可加入相关链接或参考资料）

上图展示了我使用一次性相机镜头和 iPhone 5s 拍摄的一些样本图像示例。

如果你想了解这种设计背后的原理，请查看第3步（原教程中对应内容）。

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### 接下来是荧光显微镜部分：

- 将智能手机安装在一个三脚架支架上，

- 然后将光源模块放置在手机后方，

- 把荧光样本放在智能手机和光源之间，

- 最后使用“帮助手”（helping hands）工具在样本和手机之间移动滤光片，

这个滤光片会阻挡蓝色的激发光，只让荧光通过。

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### 使用这套设备进行明场成像的效果非常出色，

但我在进行荧光成像时感到有些失望。主要问题来自 iPhone 的自动色彩和曝光校正功能。

由于无法控制这些设置，整个画面会变成蓝绿色调，导致标记了荧光的线段无法清晰呈现。

不过这个问题应该有解决办法，因为我发现了 Qingshan Wei 和 Aydogan Ozcan 所制作的智能手机荧光显微镜，他们成功克服了类似挑战。

### 第一步：制作滤光片支架

首先，你需要**3D打印滤光片支架**。STL文件如下（原教程中提供）。

将磁铁粘在滤光片支架上，注意所有磁铁的**方向要一致**。

接着，在用于固定LED的支架上粘贴方向**相反**的磁铁。

当这两个组件都被放入LED底座中时，它们会通过磁力将滤光片**牢固地固定到位**。

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### 安装USB显微镜

将USB显微镜滑入LED支架中，并**拧紧定位螺丝**以固定位置。

为了确保显微镜安装更稳固，你还可以在它的外围**贴上美纹纸胶带**，增加摩擦力防止松动。

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### 切换明场与荧光成像模式

要切换成像模式，只需**滑动滤光片支架**即可：

- 当进行**荧光成像**时，让**长通滤光片**位于USB显微镜镜头前方。

- 然后打开LED灯带，选择合适的激发光（通常是**蓝光**）。

- 接着将荧光样本滑入观察区域，就可以开始拍摄图像了。

我使用的是 Mac 上的 Digital Viewer 软件来操作 USB 显微镜。

上方是我拍摄的一些示例图像，**成像效果让我非常满意！**

### 最终设计

这一设计能提供**最高的放大倍数和最佳的成像质量**，但也是成本最高的方案。

#### 安装步骤：

1. 连接 F卡口到SM2适配器：将它安装在你的 dSLR 相机上。

2. 添加镜筒延长管：接着在适配器上旋入一个 2英寸 和 3英寸 的镜筒延长管（tube extender）。

3. 安装镜筒透镜：将 180mm 消色差双合透镜（achromatic doublet lens）安装到位。

4. 加工物镜支架：在镜头盖上钻一个孔，让光线可以通过。然后将这个盖子推入你自制的“物镜转 SM2 适配器”中（STL 文件见原教程上方）。

5. 继续连接延长管和物镜：在镜筒透镜之后，依次加入 3英寸、2英寸 和 1.5英寸 的延长管，最后连接物镜。

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### 设置相机与光学组件

- 将相机稳固地放置在桌面上。

- 在相机前方依次放置：

- 长通滤光片

- 样本

- 光源模块

我使用了来自我的 CT 扫描仪项目的 dSLR 支架（详见该项目第5步），当然你也可以使用三脚架来替代。

- 使用“帮助手”工具（helping hands）来固定滤光片，在进行明场成像时可以将其移开。

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### 成像示例说明

上面的前两张示例图像显示的是**同一份样本**，其中一张是**明场模式**拍摄，另一张是**荧光模式**拍摄。可以看出两种成像方式下结构的差异非常明显！

这正是荧光显微镜强大功能的最佳体现：如果样本标记得当，你可以**清晰地看到特定结构**，而其他部分几乎完全不显影。

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### 图像处理技巧

一个简单的图像后处理技巧是**增加对比度**。你可以在上面的两张图像中看到效果：左边是明场图像，右边是荧光图像，增强对比度后可以更清楚地分辨细节。

上方是一些荧光成像与明场成像结果的并排对比。 dSLR 显微镜设计在分辨率、对比度和整体图像质量方面表现最佳，但它的成本也是最高的。

我认为USB 显微镜是性价比最高的荧光显微镜方案，能够快速搭建并投入使用。唯一的较大开支是长通滤光片，价格大约为 60 美元。我仍在寻找更便宜的替代方案，以进一步降低整个显微镜的成本。

对于 iPhone 的成像结果我有些失望，但如果可以手动调节曝光和色彩校正，这个设计还有改进的空间（你有什么建议吗？）。

在操作便利性方面，USB 显微镜配备调焦旋钮，使得成像更加方便，相比之下，使用 dSLR 时需要精细地移动样本才能对焦。虽然市面上也有高精度的线性位移平台，但我能找到的型号大多都在 100 美元以上。我自己用卡尺制作了一个低成本位移平台原型，不过没有在这篇教程中展示。

另外，MyPhotonics 提出了一些用 乐高积木制作的平移平台设计，非常有创意。我还没有尝试这些设计，但它们看起来是另一个出色的低成本解决方案。

总结：

如果你追求性能与实用性的平衡，USB 显微镜+LED光源+滤光片的组合是一个非常值得推荐的选择。